腸(cháng)杆(gān)菌和其(qí)它(tā)非(fēi)苛養革蘭(lán)氏(shì)陰性(xìng)杆菌鑒定試(shì)劑盒（比色(sè)法）20E是經(jīng)典的微(wēi)量(liáng)生化(huà)鑒(jiàn)定係統，廣泛用(yòng)於(yú)臨床，食品，環(huán)境及科(kē)研(yán)實驗室對腸杆菌(jūn)科(kē)及部(bù)分非苛養革蘭(lán)氏陰性(xìng)杆菌的表型鑒定(dìng)。該(gāi)係統基(jī)於20項生化(huà)反應的(dí)比色(sè)或熒(yíng)光(guāng)變(biàn)化，通過(guò)數值(zhí)編(biān)碼與(yǔ)數據庫(kù)比(bǐ)對(duì)實現(xiàn)菌種(zhǒng)識別(bié)。為(wéi)確保鑒(jiàn)定結果(guǒ)的準確(què)性(xìng)與可重(zhòng)復性，嚴格(gé)遵循標(biāo)準化(huà)操(cāo)作(zuò)流(liú)程。
一，實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備(bèi)
1. 菌株(zhū)要(yào)求：待(dài)測菌應為純培養(yǎng)，18–24小(xiǎo)時(shí)新鮮培養物，生長(cháng)於非選(xuǎn)擇性培養基（如(rú)血瓊(qióng)脂或(huò)麥康凱平(píng)板），且為革蘭(lán)氏(shì)陰性(xìng)杆(gān)菌。
2. 試(shì)劑(jì)與耗(hào)材(cái)：確認(rèn)API 20E試劑條在有效(xiào)期內(nèi)，儲存(cún)於2–8°C；準備(bèi)0.85%無(wú)菌NaCl溶液，礦物油(yóu)（用於需厭氧反應(yīng)的(dí)孔(kǒng)位(wèi)）及(jí)比色(sè)卡(qiǎ)。
3. 菌液標準化(huà)：用無(wú)菌生理(lǐ)鹽水(shuǐ)或(huò)專用(yòng)懸浮液製備菌懸液(yè)，調整(zhěng)至0.5 McFarland濁度(dù)標準(zhǔn)。此濃度是(shì)保(bǎo)證反應(yīng)靈敏度與(yǔ)特(tè)異性(xìng)的(dí)關(guān)鍵，過高或(huò)過低均會(huì)導(dǎo)致(zhì)假(jiǎ)陽(yáng)性(xìng)或(huò)假陰性。
二(èr)，加(jiā)樣與孵育(yù)
1. 加樣(yàng)操(cāo)作：
使(shǐ)用接種針或微量(liáng)移液器，將(jiāng)菌懸(xuán)液(yè)依(yī)次注(zhù)入20個(gè)微(wēi)孔(kǒng)，每(měi)孔(kǒng)加(jiā)滿，避免氣泡產(chǎn)生(shēng)。
第21孔（通(tōng)常(cháng)為空白(bái)對照或(huò)用於後(hòu)續(xù)補(bǔ)充試(shì)驗(yàn)，不加(jiā)菌液。
2. 礦物油覆(fù)蓋：
對(duì)需厭(yàn)氧(yǎng)環境的生化反(fǎn)應(yīng)孔，需在加樣後覆蓋1–2滴(dī)無菌(jūn)礦物油(yóu)（約50 μL），以(yǐ)隔(gé)絕氧氣，促(cù)進(jìn)脫羧酶或硫化(huà)氫反應。具(jù)體需(xū)加(jiā)油(yóu)孔位詳(xiáng)見說(shuō)明書（通常(cháng)為孔1–7中的部分孔）。
3. 孵(fū)育條件：
將試劑(jì)條置於35±2°C恒溫培(péi)養箱中孵育18–24小時(shí)。不可縮短時間(jiān)（反(fǎn)應未完(wán)成(chéng)）或延長(cháng)超過24小(xiǎo)時（可能導致非特異(yì)性反應）。
三，結果判(pàn)讀與(yǔ)編碼
1. 顯(xiǎn)色判(pàn)讀(dú)：
孵(fū)育(yù)結束(shù)後，逐孔(kǒng)觀察(chá)顏(yán)色(sè)變化。多數反應(yīng)通(tōng)過(guò)pH指示(shì)劑顯色（如(rú)黃色(sè)=陽性(xìng)，藍(lán)色(sè)/綠色(sè)=陰性(xìng)）；H₂S反應(yīng)通過黑(hēi)色沉澱判斷；IND孔(kǒng)需加(jiā)入1滴API IND試(shì)劑(jì)（對二(èr)甲氨(ān)基(jī)苯(běn)甲醛(quán)）後(hòu)觀察紅色(sè)環(huán)（陽性）。
2. 數(shù)值編碼(mǎ)：
將20項(xiàng)結果按(àn)3-3-3-3-3-3-2分組（共7組），每(měi)組陽(yáng)性反(fǎn)應(yīng)賦值(zhí)，相(xiāng)加(jiā)得(dé)組(zǔ)值，形成(chéng)7位數字(zì)編碼。
3. 數(shù)據庫(kù)比對：
通過(guò)在綫係(xì)統(tǒng)或(huò)配套(tào)軟件輸(shū)入(rù)編碼，獲(huò)取(qǔ)鑒定結(jié)果（包(bāo)括(kuò)菌(jūn)種(zhǒng)名(míng)稱，T指(zhǐ)數/T%值）。
四，質(zhì)量(liáng)控製(zhì)與(yǔ)注(zhù)意事項
避免交叉汙染：每(měi)測(cè)試一株菌(jūn)更換(huàn)吸(xī)頭或(huò)接(jiē)種環(huán)。
不(bù)可(kě)重(zhòng)復(fù)使(shǐ)用：試(shì)劑(jì)條(tiáo)為一(yī)次性設計，禁止部分(fēn)使用(yòng)或保存(cún)再(zài)用(yòng)。
結(jié)果(guǒ)時效性(xìng)：應在孵育結束(shù)後2小(xiǎo)時(shí)內完成(chéng)判(pàn)讀(dú)，久置可(kě)能導致顏色褪(tuì)變。
結語
腸(cháng)杆菌(jūn)和其(qí)它非(fēi)苛養(yǎng)革蘭氏(shì)陰性(xìng)杆(gān)菌鑒(jiàn)定試劑盒（比色法(fǎ)）20E作(zuò)為經典的表型鑒定工具(jù)，其操(cāo)作雖(suī)看似簡(jiǎn)單，但每一步(bù)均(jūn)影(yǐng)響鑒定準(zhǔn)確性。隻(zhī)有嚴格(gé)遵循(xún)標準化(huà)流(liú)程(chéng)，注(zhù)重菌(jūn)液濃度，孵(fū)育時(shí)間(jiān)，顯色判(pàn)讀(dú)等(děng)細(xì)節，並(bìng)結合質控(kòng)與(yǔ)數據庫更新，才能充(chōng)分發揮其(qí)在革蘭氏(shì)陰(yīn)性杆菌鑒(jiàn)定中(zhōng)的(dí)價值(zhí)。
手(shǒu)機(jī)： 
