一
，實(shí)驗(yàn)前(qián)準(zhǔn)備

1. 試劑(jì)與耗(hào)材(cái)
   • 檢查試(shì)劑(jì)盒(hé)組分(fēn)：裂(liè)解(jiě)液(yè)(Buffer AL/BL)
     ，洗滌(dí)液(Buffer AW1/AW2)
     ，洗脫液(Buffer AE)
     ，蛋白酶K
     ，吸附柱
     ，收(shōu)集管等。
   • 自(zì)備物品：無水乙醇(chún)(如(rú)需添加(jiā)到(dào)洗(xǐ)滌(dí)液(yè)中)
     ，離(lí)心機
     ，移液(yè)器
     ，1.5mL離心管(guǎn)
     ，渦旋振蕩(dàng)器
     ，水浴鍋(或(huò)金屬浴)。
2. 樣本(běn)處(chǔ)理
   • 使(shǐ)用EDTA抗凝全(quán)血，確保樣本未溶血。若樣(yàng)本(běn)量不足(zú)，可用(yòng)生(shēng)理(lǐ)鹽(yán)水(shuǐ)或PBS稀(xī)釋至推薦(jiàn)體積(如(rú)200-500μL)。

二
，詳細操(cāo)作(zuò)步驟(zhòu)

步(bù)驟(zhòu)1：紅(hóng)細胞(bāo)裂解(可選(xuǎn)，視試(shì)劑盒(hé)設計而定)

• 目的：去除紅細(xì)胞(bāo)，保(bǎo)留白(bái)細胞核(hé)。
• 操作(zuò)：
  1. 將(jiāng)全血樣本(běn)轉移至15mL離心(xīn)管(guǎn)，加入(rù)3-5倍體積(jī)的(dí)紅細胞(bāo)裂解(jiě)液(yè)(如(rú)Buffer EL)。
  2. 顛(diān)倒(dǎo)混匀後，室溫(wēn)靜置5-10分(fēn)鐘(zhōng)，期(qī)間輕彈(dàn)管底以(yǐ)促進(jìn)裂解(jiě)。
  3. 2000×g離心(xīn)5分鐘，棄上(shàng)清(qīng)(含(hán)裂解的(dí)紅細(xì)胞(bāo))。
  4. 重復(fù)上(shàng)述步驟直(zhí)至沉(chén)澱(diàn)呈(chéng)白(bái)色(白(bái)細(xì)胞團塊(kuài))。

步驟2：細胞裂解與(yǔ)DNA釋放

• 目的：裂(liè)解白(bái)細胞，釋放(fàng)基(jī)因組DNA。
• 操(cāo)作：
  1. 向(xiàng)白(bái)細胞(bāo)沉澱(diàn)中(zhōng)加(jiā)入(rù)200μL Buffer AL(含(hán)蛋白酶(méi)K)，渦旋振(zhèn)蕩(dàng)15秒(miǎo)。
  2. 56℃水浴(yù)孵育10-30分鐘(或根據(jù)試(shì)劑盒(hé)要(yào)求)，期(qī)間每隔5分鐘渦旋一次(cì)。
  3. 孵(fū)育(yù)後短(duǎn)暫離心(xīn)，使(shǐ)管蓋(gài)液體(tǐ)回落(là)。

步驟3：DNA結合至(zhì)吸附(fù)柱

• 目的：將(jiāng)DNA吸(xī)附到矽膠膜上。
• 操作：
  1. 向裂解液中加入200μL無(wú)水(shuǐ)乙醇，渦旋混匀(若試劑盒已(yǐ)預加(jiā)乙醇，則跳(tiào)過此(cǐ)步)。
  2. 將(jiāng)混(hùn)合(hé)液(yè)轉移(yí)至吸附柱(zhù)(置於2mL收集(jí)管中(zhōng))，8000×g離心1分鐘(zhōng)。
  3. 棄收集管中(zhōng)廢液，將(jiāng)吸附(fù)柱放(fàng)回原(yuán)收集(jí)管(guǎn)。

步驟4：洗滌純(chún)化DNA

• 目的：去(qù)除(chú)蛋白質
  ，鹽分(fēn)等(děng)雜(zá)質。
• 操作：
  1. 向吸附柱中加入500μL Buffer AW1，8000×g離(lí)心1分鐘，棄廢液。
  2. 加(jiā)入(rù)500μL Buffer AW2(含乙醇(chún))，14000×g離心(xīn)3分(fēn)鐘，去除殘留乙醇。
  3. 重(zhòng)復(fù)離心一次(空(kōng)管)，確(què)保(bǎo)吸(xī)附柱(zhù)幹燥。

步(bù)驟5：DNA洗脫與收(shōu)集

• 目的(dí)：將純化的DNA從吸附(fù)柱上洗脫(tuō)。
• 操(cāo)作：
  1. 將吸附(fù)柱轉移至新的1.5mL離(lí)心管，向膜(mó)中央(yāng)加入(rù)100-200μL預熱至65℃的Buffer AE。
  2. 室溫(wēn)靜置(zhì)5分(fēn)鐘，8000×g離心1分鐘(zhōng)。
  3. 可(kě)選擇重復洗(xǐ)脫一次以(yǐ)提(tí)高(gāo)回收率(shuài)(將洗脫(tuō)液(yè)重新(xīn)加(jiā)入吸(xī)附柱，再(zài)次離心)。

三(sān)
，關(guān)鍵注(zhù)意事(shì)項

1. 溫度控製
   • 蛋白酶K裂(liè)解(jiě)步(bù)驟需在56℃進(jìn)行(háng)，溫度過(guò)低(dī)會導致裂解不完全。
   • 洗(xǐ)脫液預熱至65℃可提(tí)高DNA洗(xǐ)脫效率。
2. 乙醇(chún)添(tiān)加
   • 若洗(xǐ)滌液(yè)需自行添(tiān)加(jiā)乙醇，務必使用(yòng)無水乙(yǐ)醇(chún)，並確保(bǎo)終濃(nóng)度(dù)符(fú)合(hé)試劑盒要求。
3. 離心條(tiáo)件
   • 離心速(sù)度(dù)和時(shí)間需(xū)嚴(yán)格遵(zūn)循說明書(shū)，避免(miǎn)DNA斷裂或吸附(fù)不(bù)完(wán)全(quán)。
4. 避免汙(wū)染
   • 所(suǒ)有(yǒu)操作(zuò)應在無菌條件下進行(háng)，使(shǐ)用(yòng)無DNA酶的(dí)耗材和移(yí)液(yè)器吸(xī)頭(tóu)。

四
，結(jié)果評(píng)估

• 濃度(dù)與純(chún)度：使(shǐ)用(yòng)分(fēn)光光(guāng)度計(jì)測定(dìng)DNA濃度(A260)和純度(dù)(A260/A280=1.8-2.0)。
• 完(wán)整性：通(tōng)過(guò)瓊(qióng)脂糖(táng)凝(níng)膠電泳檢測DNA條帶(dài)(主(zhǔ)帶應(yīng)集(jí)中(zhōng)於(yú)基因(yīn)組DNA大小(xiǎo)區域(yù))。

五
，常(cháng)見問題(tí)與(yǔ)解決方(fāng)案(àn)